Амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции

ПЦР обозначает полимеразной цепной реакцииметод молекулярной биологии для амплификации сегментов ДНК путем генерирования нескольких копий с использованием ферментов ДНК-полимеразы в контролируемых условиях. Всего одна копия сегмента или гена ДНК может быть клонирована в миллионы копий, что позволяет обнаруживать с помощью красителей и других методов визуализации.

Разработанный в 1983 году процесс ПЦР позволил выполнить Секвенирование ДНК и определить порядок нуклеотидов в отдельных генах. Метод использует термоциклирование или повторное нагревание и охлаждение реакции для плавления и репликации ДНК. Поскольку ПЦР продолжается, «новая» ДНК используется в качестве матрицы для репликации, и возникает цепная реакция, экспоненциально усиливающая матрицу ДНК.

Методы ПЦР применяются во многих областях биотехнологии, включая белковая инженерия, клонирование, криминалистика (ДНК-фингерпринтинг), тестирование отцовства, диагностика наследственных и / или инфекционных заболеваний, а также для анализ образцов окружающей среды.

В частности, в криминалистике ПЦР особенно полезна, поскольку она усиливает даже минимальное количество доказательств ДНК. ПЦР также может быть использован для анализа ДНК, которой тысячи лет, и эти методы используются для идентификации всего, от мамонта возрастом 800 000 лет до мумий со всего мира.

Этот шаг необходим только для ДНК-полимераз, которые требуют горячего старта ПЦР. Реакционную смесь нагревают до температуры между 94 и 96 ° С и выдерживают в течение 1-9 минут.

Если процедура не требует инициализации, денатурация является первым шагом. Реакционную смесь нагревают до 94-98 ° С в течение 20-30 секунд. Водородные связи матрицы ДНК разрушаются, и создаются одноцепочечные молекулы ДНК.

Температура реакции ниже от 50 до 65 ° С и выдерживается в течение 20-40 секунд. Праймеры отжигают на одноцепочечной матрице ДНК. Температура чрезвычайно важна на этом этапе. Если слишком жарко, грунтовка может не связываться. Если слишком холодно, грунтовка может связываться не идеально. Хорошая связь образуется, когда последовательность праймера близко соответствует последовательности матрицы.

Температура на этом этапе изменяется в зависимости от типа полимеразы. ДНК-полимераза синтезирует совершенно новую цепь ДНК.

Этот этап выполняют при 70-74 ° С в течение 5-15 минут после заключительного цикла ПЦР.

Этот шаг не является обязательным. Температура поддерживается на уровне 4-15 ° С и замедляет реакцию.

Во время каждого цикла продукт (конкретный фрагмент ДНК, который реплицируется) удваивается.

Поскольку ДНК-полимераза теряет активность и потребляет реагенты, реакция замедляется.

Больше продукт не накапливается.