Процедура окрашивания по Граму в микробиологии

Окрашивание по Граму - это дифференциальный метод окрашивания, используемый для бактерии к одной из двух групп (грамположительных и грамотрицательных) на основе свойств их клеточные стенки. Он также известен как окрашивание по Граму или метод по Граму. Процедура названа в честь человека, разработавшего методику, датского бактериолога Ганса Христиана Грама.

Процедура основана на реакции между пептидогликаном в клеточных стенках некоторых бактерий. Окрашивание по Граму включает окрашивание бактерий, фиксацию цвета с помощью протравы, обесцвечивание клеток и нанесение контрстейна.

1. Первичное пятно (кристально фиолетовый) связывается с пептидогликаном, окрашивая клетки в пурпурный цвет. Как грамположительные, так и грамотрицательные клетки имеют пептидогликан в клеточных стенках, поэтому изначально все бактерии окрашивают в фиолетовый цвет.
2. Грамм йода (йод и йодид калия) применяется в качестве протравы или фиксатора. Грамположительные клетки образуют кристаллический фиолетово-йодный комплекс.
instagram viewer
3. Алкоголь или ацетон используется для обесцвечивания клеток. В клеточных стенках грамотрицательных бактерий гораздо меньше пептидогликана, поэтому этот шаг по существу делает их бесцветными, в то время как только часть цвета удаляется из грамположительных клеток, которые имеют больше пептидогликана (60-90% клеточной стенки). Толстая клеточная стенка грамположительных клеток обезвоживается на стадии обесцвечивания, что приводит к их усадке и захвату пятно-йодного комплекса внутри.
4. После стадии обесцвечивания применяется окраска (обычно сафранин, но иногда фуксин) для окрашивания бактерий в розовый цвет. Как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии улавливают розовое пятно, но оно не видно на более темном пурпурном грамположительных бактерий. Если процедура окрашивания выполнена правильно, грамположительные бактерии будут фиолетовыми, а грамотрицательные бактерии будут розовыми.

Результаты окраски по Граму просматриваются с помощью световой микроскопии. Поскольку бактерии окрашены, идентифицируется не только их группа окраски по Граму, но и их форма, размер и структура комков могут наблюдаться. Это делает окраску по Граму ценным диагностическим инструментом для медицинской клиники или лаборатории. Хотя пятно может не идентифицировать бактерии, часто для того, чтобы назначить эффективный антибиотик, достаточно знать, являются ли они грамположительными или грамотрицательными.

Некоторые бактерии могут быть грам-вариабельными или грамм-неопределенными. Однако даже эта информация может быть полезна для сужения бактериальной идентичности. Техника наиболее надежна, когда культурам менее 24 часов. Хотя его можно использовать на бульонных культурах, лучше всего сначала центрифугировать его. Основное ограничение метода состоит в том, что он дает ошибочные результаты, если в методе допущены ошибки. Практика и навыки необходимы для получения надежного результата. Кроме того, инфекционный агент не может быть бактериальным. Эукариотические возбудители пятен грамотрицательные. Однако большинство эукариотические клетки кроме грибков (в том числе дрожжей) не могут прилипать к слайду во время процесса.

• Кристально фиолетовый (первичное пятно)
• Йод Грамма (протрава, для фиксации кристаллического фиолетового в клеточной стенке)
• Этанол или Ацетон (обесцвечиватель)
• Сафранин (вторичное пятно или контрастная окраска)
• Вода в бутылке для стирки или капельнице
• Слайды микроскопа
• Составной микроскоп

1. Поместите небольшую каплю бактериального образца на предметное стекло. Нагрейте бактерии на предметном стекле, пропустив его три раза через пламя горелки Бунзена. Подавая слишком много тепла или слишком долго, можно растопить стенки клеток бактерий, исказить их форму и привести к неточным результатам. Если приложить слишком мало тепла, бактерии смоют предметное стекло во время окрашивания.
2. Используйте капельницу, чтобы нанести основное пятно (кристаллический фиолетовый) на предметное стекло и оставьте на 1 минуту. Аккуратно промойте слайд водой не более 5 секунд, чтобы удалить лишнее пятно. Слишком долгое полоскание может привести к удалению слишком большого количества цвета, в то время как недостаточное полоскание может привести к тому, что на грамотрицательных клетках останется слишком много пятен.
3. Используйте капельницу, чтобы нанести йод Грэма на предметное стекло, чтобы закрепить кристаллический фиолетовый на клеточной стенке. Оставьте на 1 минуту.
4. Промойте предметное стекло спиртом или ацетоном в течение 3 секунд, а затем сразу же осторожно промойте водой. Грамотрицательные клетки потеряют цвет, тогда как грамположительные клетки останутся фиолетовыми или синими. Однако, если оставить обесцвечиватель на слишком долгое время, все клетки потеряют цвет!
5. Нанесите вторичное пятно сафранина и оставьте на 1 минуту. Аккуратно промойте водой не более 5 секунд. Грамотрицательные клетки должны быть окрашены в красный или розовый цвет, в то время как грамположительные клетки все еще будут выглядеть фиолетовыми или синими.
6. Просмотрите слайд с помощью составного микроскопа. Увеличение от 500x до 1000x может потребоваться для различения формы и расположения ячеек.

Не все бактерии, идентифицированные окраской по Граму, связаны с заболеваниями, но несколько важных примеров включают в себя:

• Грамположительные кокки (круглые):Золотистый стафилококк
• Грамотрицательные кокки:Neisseria meningitidis
• Грамположительные палочки (палочки): бацилла сибирской язвы
• Грамотрицательные бациллы:кишечная палочка