Рестрикционные эндонуклеазы представляют собой класс фермент которые режут молекулы ДНК. Каждый фермент распознает уникальные последовательности нуклеотидов в цепи ДНК - обычно длиной от четырех до шести пар оснований. Последовательности являются палиндромными в том смысле, что цепь комплементарной ДНК имеет ту же последовательность в обратном направлении. Другими словами, обе нити ДНК разрезаны в одном и том же месте.
Где эти ферменты находятся
Рестрикционные ферменты обнаруживаются во многих различных штаммах бактерий, где их биологическая роль заключается в участии в защите клеток. Эти ферменты ограничивают чужеродную (вирусную) ДНК, которая проникает в клетки, уничтожая их. Клетки-хозяева имеют рестрикционно-модифицированную систему, которая метилирует свою собственную ДНК в сайтах, специфичных для их соответствующих рестрикционных ферментов, тем самым защищая их от расщепления. Более 800 известные ферменты были обнаружены, которые распознают более 100 различных нуклеотидных последовательностей.
Типы рестриктаз
Существует пять различных типов ферментов рестрикции. Тип I разрезает ДНК в случайных местах на расстоянии 1000 или более пар оснований от сайта распознавания. Тип III режет примерно в 25 пар оснований от участка. Оба эти типа требуют АТФ и могут быть большими ферментами с несколькими субъединицами. Ферменты типа II, которые преимущественно используются в биотехнологии, перерезают ДНК в пределах распознаваемой последовательности без необходимости в АТФ и имеют меньшие размеры и проще.
Ферменты рестрикции типа II названы в соответствии с бактериальными видами, из которых они выделены. Например, фермент EcoRI был выделен из E. палочка. Большая часть публики знакома с Э. вспышки коли в пище.
Ферменты рестрикции типа II могут генерировать два разных типа срезов в зависимости от того, срезают ли они оба нити в центре последовательности распознавания или каждая нить ближе к одному концу распознавания последовательность.
Первый разрез будет генерировать «тупые концы» без выступов нуклеотидов. Последний генерирует «липкие» или «связные» концы, потому что каждый полученный фрагмент ДНК имеет выступ, дополняющий другие фрагменты. Оба полезны в молекулярной генетике для создания рекомбинантная ДНК и белки. Эта форма ДНК выделяется тем, что она получается путем лигирования (связывания) двух или более разных нитей, которые изначально не были связаны друг с другом.
Ферменты типа IV распознают метилированную ДНК, а ферменты типа V используют РНК для разрезания последовательностей на вторгающихся организмах, которые не являются палиндромными.
Использование в биотехнологии
Рестрикционные ферменты используются в биотехнологии для разрезания ДНК на более мелкие нити с целью изучения различий в длине фрагментов у отдельных людей. Это называется полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (RFLP). Они также используются для клонирования генов.
Методы RFLP были использованы для определения того, что индивидуумы или группы индивидуумов имеют отличительные различия в последовательностях генов и паттернах рестрикционного расщепления в определенных областях генома. Знание этих уникальных областей является основой для Дактилоскопия ДНК. Каждый из этих методов зависит от использования электрофорез в агарозном геле для разделения фрагментов ДНК. TBE-буфер, который состоит из трис-основания, борной кислоты и EDTA, обычно используется для агарозного геля электрофорез исследовать продукты ДНК.
Использовать в клонировании
Клонирование часто требует вставки гена в плазмиду, которая является разновидностью фрагмента ДНК. Рестрикционные ферменты могут помочь с процессом из-за одноцепочечных выступов, которые они оставляют, когда они делают сокращения. ДНК-лигаза, отдельный фермент, может объединять две молекулы ДНК с совпадающими концами.
Таким образом, используя ферменты рестрикции с ферментами ДНК-лигаза, кусочки ДНК из разных источников могут быть использованы для создания одной молекулы ДНК.