Методы очистки белка в биотехнологии

Важным компонентом биотехнологических исследований является использование методов белковой инженерии для разработки или модификации белков. Эти методы очистки белка оптимизируют свойства белка для конкретных промышленных применений.

Эти методы требуют от ученых выделения и очистки представляющих интерес белков, чтобы можно было изучить их конформации и специфические особенности субстрата. Также требующими изучения являются реакции с другими лигандами (белок, который присоединяется к белку рецептора) и специфические ферментативные активности.

Требуемая степень чистоты белка зависит от предполагаемого конечного использования белка. Для некоторых применений достаточно сырого экстракта. Для других целей, таких как продукты питания и фармацевтика, требуется высокий уровень чистоты. Несколько методов для очистка белка используются для достижения требуемого уровня чистоты.

Каждый этап очистки белка обычно приводит к некоторой степени потери продукта. Таким образом, идеальная стратегия очистки белка - это стратегия, при которой наивысший уровень очистки достигается за минимальное количество этапов.

Выбор того, какие этапы использовать, зависит от размера, заряда, растворимости и других свойств целевого белка. Следующие методы являются наиболее подходящими для очистки одного цитозольного белка.

Очистка цитозольных белковых комплексов является более сложной и обычно требует применения различных методов.

Первым этапом очистки внутриклеточных (внутри клетки) белков является подготовка неочищенного экстракта. Экстракт будет содержать сложную смесь всех белков из цитоплазмы клетки и некоторых дополнительных макромолекул, кофакторов и питательных веществ.

Этот сырой экстракт может быть использован для некоторых применений в биотехнологии. Однако, если проблема заключается в чистоте, необходимо следовать последующим этапам очистки. Сырые белковые экстракты получают путем удаления клеточных остатков, образующихся при лизисе клеток, что достигается с помощью химических веществ, ферменты, sonication или французская пресса.

Обломки удаляют центрифугированием, и супернатант (жидкость над твердым остатком) извлекают. Сырые препараты внеклеточных (вне клетки) белков могут быть получены простым удалением клеток центрифугированием.

Для некоторых биотехнология приложений, существует потребность в термостабильных ферментах - ферментах, которые могут переносить высокие температуры без денатурирования, сохраняя при этом высокую удельную активность.

Организмы, которые производят термостойкие белки, иногда называют экстремофилами. Простой подход к очистке термостойкого белка состоит в денатурировании других белков в смеси путем нагревание, затем охлаждение раствора (таким образом, позволяя термостабильному ферменту преобразовываться или растворяться, необходимо). Затем денатурированные белки могут быть удалены центрифугированием.

Современное биотехнологической протоколы часто используют многие коммерчески доступные наборы или методы, которые предоставляют готовые решения для стандартных процедур. Очистка белка часто проводится с использованием фильтров и подготовленных гель-фильтрационных колонн.

Следуйте инструкциям набора для диализа и добавьте нужный объем правильного раствора и дождитесь заданный промежуток времени при сборе элюента (растворитель проходил через колонку) в свежем тесте труба.

Хроматографические методы могут применяться с использованием настольных колонок или автоматизированного оборудования ВЭЖХ. Разделение с помощью ВЭЖХ может быть выполнено методами обращенной фазы, ионного обмена или исключения по размеру, а образцы обнаружены с помощью диодной матрицы или лазерной технологии.

В прошлом обычным вторым этапом очистки белка от неочищенного экстракта было осаждение в растворе с высокой осмотической силой (то есть в солевых растворах). Осаждение белка обычно проводится с использованием сульфата аммония в качестве соли. Нуклеиновые кислоты в неочищенном экстракте могут быть удалены осаждением агрегатов, образованных сульфатом стрептомицина или сульфатом протамина.

Осаждение соли обычно не приводит к высокоочищенному белку, но может помочь в удалении некоторых нежелательных белков в смеси и концентрировании образца. Затем соли в растворе удаляют диализом через пористые целлюлозные трубки, фильтрацию или гель-эксклюзионную хроматографию.

Различные белки будут осаждаться в различных концентрациях сульфата аммония. Как правило, белки с более высокой молекулярной массой осаждаются в более низких концентрациях сульфата аммония.

Хроматография с обращенной фазой (RPC) разделяет белки на основе их относительной гидрофобности (исключение неполярных молекул из воды). Этот метод очень избирателен, но требует использования органических растворителей.

Некоторые белки постоянно денатурируются растворителями и теряют функциональность во время RPC. Поэтому этот метод не рекомендуется для всех применений, особенно если необходимо, чтобы целевой белок сохранял активность.

Ионообменная хроматография относится к разделению белков на основе заряда. Колонны могут быть подготовлены для анионного или катионного обмена. Анионообменные колонки содержат стационарную фазу с положительным зарядом, которая притягивает отрицательно заряженные белки.

Катионообменные колонки представляют собой обратные отрицательно заряженные шарики, которые привлекают положительно заряженные белки. Элюция (извлечение одного материала из другого) целевого белка (ов) осуществляется путем изменения рН в столбец, который приводит к изменению или нейтрализации заряженных функциональных групп каждого белка.

Эксклюзионная хроматография (также известная как гель-фильтрация) отделяет большие белки от меньших так как более крупные молекулы быстрее проходят через сшитый полимер в хроматографии колонка. Большие белки не вписываются в поры полимера, в то время как меньшие белки делают это, и им требуется больше времени, чтобы пройти через хроматографическую колонку менее прямым путем.

Элюат (результат элюции) собирают в серию пробирок, разделяющих белки в зависимости от времени элюирования. Гель-фильтрация является полезным инструментом для концентрирования образца белка, поскольку целевой белок собирается в меньшем объеме элюирования, чем он был первоначально добавлен в колонку. Подобные методы фильтрации могут быть использованы во время крупномасштабного производства белка из-за их экономической эффективности.

Аффинная хроматография является очень полезным методом для «полировки» или завершения процесса очистки белка. Гранулы в колонке для хроматографии сшиты с лигандами, которые специфически связываются с целевым белком.

Затем белок удаляют из колонки путем промывания раствором, содержащим свободные лиганды. Этот метод дает самые чистые результаты и самую высокую удельную активность по сравнению с другими методами.

SDS-PAGE (додецилсульфат натрия, используемый при электрофорезе в полиакриламидном геле) связывается с белками, придавая им большой чистый отрицательный заряд. Поскольку заряды всех белков довольно равны, этот метод разделяет их почти полностью в зависимости от размера.

SDS-PAGE часто используется для проверки чистоты белка после каждого шага в серии. Поскольку нежелательные белки постепенно удаляются из смеси, количество полос, визуализируемых на геле SDS-PAGE, уменьшается до тех пор, пока не останется только одна полоса, представляющая желаемый белок.

Иммуноблоттинг - это метод визуализации белка, применяемый в сочетании с аффинной хроматографией. Антитела к конкретному белку используют в качестве лигандов на колонке для аффинной хроматографии.

Целевой белок сохраняется на колонке, затем удаляется путем промывания колонки солевым раствором или другими агентами. Антитела, связанные с радиоактивными или красящими метками, помогают в обнаружении целевого белка, как только он отделен от остальной смеси.