Поле биотехнология это один из постоянных изменений. Быстрый рост и развитие передовых исследований зависят от инноваций и креативности ученые и их способность видеть потенциал в основной молекулярной технике и применять ее к новым процессы. Появление полимеразной цепной реакции (ПЦР) открыл много дверей в генетических исследованиях, в том числе средства Анализ ДНК и идентификация различных генов на основе их последовательностей ДНК. Секвенирование ДНК также зависит от нашей способности использовать гель-электрофорез разделить нити ДНК, которые различаются по размеру всего на одну пару оснований.
Секвенирование ДНК
В конце 1970-х годов были изобретены две методики секвенирования ДНК для более длинных молекул ДНК: метод Сангера (или дидезокси) и метод Максама-Гилберта (химическое расщепление). Метод Максама-Гилберта основан на нуклеотид-специфическом расщеплении химическими веществами и лучше всего используется для секвенирования олигонуклеотидов (короткие нуклеотидные полимеры, обычно длиной менее 50 пар оснований). Метод Сэнгера используется чаще, поскольку его применение оказалось технически более простым, а с Появление ПЦР и автоматизация метода, легко применяются к длинным цепям ДНК, включая некоторые Гены. Этот метод основан на терминации цепи дидезоксинуклеотидами во время реакций элонгации ПЦР.
Метод Сэнгера
В методе Сангера анализируемая цепь ДНК используется в качестве матрицы, а ДНК-полимераза используется в реакции ПЦР для получения комплементарных цепей с использованием праймеров. Готовят четыре различные реакционные смеси ПЦР, каждая из которых содержит определенный процент дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP) аналогов одного из четырех нуклеотидов (АТФ, CTP, GTP или TTP).
Синтез новой цепи ДНК продолжается до тех пор, пока один из этих аналогов не будет включен, и в это время цепь преждевременно обрезается. Каждая реакция ПЦР будет содержать смесь нитей ДНК различной длины, причем все они будут заканчиваться нуклеотидом, который был помечен для этой реакции дидезокси. Гель электрофорез затем используется для разделения цепей четырех реакций в четырех отдельных дорожках и определения последовательности исходной матрицы на основе того, какая длина цепей заканчивается каким нуклеотидом.
В автоматизированной реакции Сэнгера используются праймеры, которые помечены четырьмя флуоресцентными метками разного цвета. Реакции ПЦР в присутствии различных дидезоксинуклеотидов проводят, как описано выше. Однако затем четыре реакционные смеси затем объединяют и наносят на одну дорожку геля. Цвет каждого фрагмента определяется с помощью лазерного луча, а информация собирается с помощью компьютера. который генерирует хроматограммы, показывающие пики для каждого цвета, из которого может быть определяется.
Как правило, метод автоматического секвенирования является точным только для последовательностей длиной максимум до 700-800 пар оснований. Однако можно получить полные последовательности более крупных генов и, по сути, целых геномов, используя пошаговые методы, такие как ходьба праймера и секвенирование из дробовика.
В Primer Walking обрабатываемую часть большого гена секвенируют с использованием метода Сэнгера. Новые праймеры генерируются из надежного сегмента последовательности и используются для продолжения секвенирования той части гена, которая находилась вне диапазона исходных реакций.
Секвенирование дробовика влечет за собой случайное разделение интересующего сегмента ДНК на более подходящее (управляемые) размерные фрагменты, упорядочивая каждый фрагмент и упорядочивая фрагменты на основе перекрытия последовательности. Этот метод стал проще благодаря применению компьютерного программного обеспечения для организации перекрывающихся элементов.